Analisi dell’azoto totale Kjeldahl
Nella produzione di vaccini farmaceutici, è necessario controllare il livello degli antigeni nei prodotti iniziali, intermedi e finali. Questi prodotti vengono testati per la quantità di virus o batteri attenuati o devitalizzati presenti. Poiché gli antigeni sono principalmente costituiti da proteine, la quantificazione analitica delle proteine totali rappresenta il metodo preferito per valutare la presenza degli antigeni. In questo caso possono essere importanti degli strumenti per l’analisi dell’azoto totale Kjeldhal.
La quantificazione analitica delle proteine totali
La determinazione dell’azoto e delle proteine totali nei prodotti farmaceutici è descritta nella Farmacopea Europea (Ph.Eur.) nella sezione 2.5.9 e nel metodo 7 della sezione 2.5.33. Nella Farmacopea degli Stati Uniti (USP), la determinazione dell’azoto è descritta nella sezione 461.
Questi metodi compendiali svolgono un ruolo fondamentale nel garantire la qualità e la coerenza dei prodotti farmaceutici, determinando il contenuto di azoto e proteine totali. L’utilizzo di questi metodi analitici consente di garantire il controllo qualitativo e la coerenza dei vaccini farmaceutici, poiché permettono di valutare in modo accurato la quantità di proteine totali e di conseguenza degli antigeni presenti nei prodotti.
Determinazione dell’azoto Kjeldhal
Le normative delle farmacopee includono diversi metodi rilevanti per tale scopo. Tra questi, si trovano due metodi per la determinazione dell’azoto totale: il metodo Kjeldahl e il metodo di combustione catalitica.
Abbiamo parlato del metodo in combustione catalitica nel seguente articolo: Controlli di antigeni sui vaccini tramite determinazione dell’Azoto Totale
La determinazione dell’azoto Kjeldhal, invece, si può eseguire come descritto di seguito, mediante l’utilizzo degli strumenti per l’analisi dell’azoto totale Kjeldhal di Opsis LiquidLINE.
KjelROC è un sistema automatico per la determinazione dell’azoto Kjeldahl, che permette di far fronte in modo affidabile e rapido alle esigenze analitiche del settore farmaceutico. Diversi aspetti costruttivi rendono KjelROC particolarmente innovativo; tra questi, la titolazione predittiva è certamente il più importante in termini di ripetibilità, accuratezza e velocità di analisi.
La titolazione predittiva
La titolazione predittiva è una parte fondamentale del sistema, perché permette di velocizzare la titolazione senza ridurre la precisione analitica ma addirittura migliorandola: la buretta da 50 ml permette step di aggiunte di volumi di titolante (HCl) pari a 1.95 µl e mediante un sensore ottico è possibile apprezzare le minime variazioni di colore per identificare il corretto punto di equivalenza. Il sensore è posizionato sul fondo ed è in grado di leggere tutto il volume del recipiente di titolazione.
La titolazione predittiva utilizza algoritmi avanzati insieme a misurazioni del colore per prevedere continuamente il dosaggio richiesto dalla buretta, garantendo un LOD di 0.006 mgN e un LOQ di 0.018 mgN.
Preparazione e Digestione
Per eseguire l’analisi dell’azoto totale, i campioni devono essere preventivamente digeriti con acido solforico e l’ausilio di un catalizzatore. Il campione, l’acido solforico e il catalizzatore vengono inseriti nei tubi in vetro, alloggiati in un blocco di alluminio; il volume di campione da analizzare è normalmente funzione del range di concentrazione di azoto atteso, e deve essere scelto per ottenere un contenuto di azoto totale superiore a 0,05 mg per ottenere una buona deviazione standard. Il digestore raggiunge la temperatura di 450 °C (riscaldamento rapido da 20 °C a 450 °C in 45 minuti).
I fumi acidi che fuoriescono dai tubi durante la digestione sono raccolti attraverso la parte superiore dei tubi nell’exhaust. Un o-ring di tenuta in PTFE viene interposto tra l’estremità superiore dei tubi e l’exhaust, la cappa di aspirazione dei fumi acidi, assicurando una piccola presa d’aria e impedendo la fuoriuscita di vapori e gas dalla digestione. I gas provenienti da diversi tubi vengono raccolti dall’exhaust e convogliati all’esterno.
L’exhaust prevede due punti di suzione dei gas acidi posizionati su due lati opposti; questa specifica rende omogenea l’evacuazione dei gas acidi di decomposizione e garantisce l’uniformità di trattamento dei singoli campioni presenti nel blocco di digestione. È importante che l’uscita dell’exhaust sia collegata a un’aspirazione esterna in modo da ottenere un’aspirazione efficiente dei fumi.
Distillazione e titolazione
Una volta completato il processo di digestione, a seguito del raffreddamento, si può procedere all’analisi dell’azoto mediante l’analizzatore KjelROC, che provvederà in maniera automatica alla distillazione e alla titolazione.
Il tubo in vetro contenente il campione precedentemente digerito viene posizionato nell’alloggiamento dell’analizzatore e si seleziona il metodo di distillazione desiderato attraverso il software caricato su un terminale presente sul corpo macchina. In maniera automatica, viene introdotto il volume di acqua (70 ml) per la diluizione del campione precedentemente digerito e il volume di NaOH al 40% (50 ml) per convertire NH4+ (solido) in NH3 (gassoso). Quest’ultima viene trasportata al titolatore colorimetrico mediante una corrente di vapore il cui flusso è regolato tra il 10% e il 100% e in maniera automatica viene introdotta la soluzione ricevente di acido borico (30 ml) per “catturare” l’ammoniaca disciolta, infine titolata per via colorimetrica con HCl (0,0500 N). Il contenuto di azoto misurato è dunque calcolato dalla quantità di ammoniaca determinata.
