Monitoraggio dei livelli di glucosio nel sangue
La valutazione, più volte al giorno, dei livelli di glucosio nel sangue è fondamentale per i pazienti diabetici, al fine di prevenire gravi conseguenze di ipo o iperglicemia e per ottimizzare la terapia insulinica. Il monitoraggio dei livelli di glucosio è spesso necessario anche nei pazienti con circolazione extracorporea, durante emodialisi o nel corso di alcuni tipi di interventi chirurgici. È essenziale mantenere la concentrazione di glucosio nel sangue entro il range di 70-180 mg/dL.
I tipi più comuni di dispositivi portatili point-of-care (PoC) utilizzano reazioni enzimatiche con la determinazione della luce trasmessa, ma i risultati dipendono molto dalla miscelazione del sangue intero con sostanze aggiuntive al momento della misura.
I sistemi di monitoraggio continuo del glucosio consentono invece il monitoraggio durante il giorno, ad esempio mediante un piccolo sensore posizionato sotto la cute. I livelli così misurati, leggermente ritardati rispetto ai livelli di glucosio nel sangue, vengono letti dal sensore e trasferiti in modalità wireless a un ricevitore che memorizza i dati permettendo di visualizzarli. Tutte queste tecniche richiedono procedure invasive, con un potenziale aumento del rischio di contaminazione o infezione per il paziente.
Le tecniche di risonanza magnetica (RM) sono ben note per fornire una valutazione completamente senza contatto della composizione chimica dei campioni. L’area di picco di una sostanza determinata in NMR è direttamente correlata alla sua concentrazione; questo aspetto rende la tecnica un metodo non distruttivo, robusto e a altamente riproducibile per l’analisi quantitativa. Tuttavia, la valutazione della glicemia in un sistema extracorporeo, o addirittura all’interno del corpo, è impegnativa.
L’utilizzo della Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare
Le molecole di glucosio (C6H12O6) presentano un sistema di spin relativamente complesso, con dettagli del pattern del segnale NMR dipendenti dal campo magnetico. Gli spettrometri ad alto campo forniscono un’elevata sensibilità e larghezze di riga ridotte, quindi una buona separazione dei segnali del glucosio da altri componenti del segnale nel sangue, ma le condizioni peggiorano alla diminuzione dell’intensità del campo magnetico e alla minore omogeneità del campo.
Recenti studi però propongono sistemi molto compatti e con prestazioni molto più elevate rispetto al passato. Per questo studio si è scelto uno spettrometro da banco da 1 T e tempi di acquisizione moderati, inferiori a 15 min, eseguendo acquisizioni FID 1H dopo l’eccitazione dell’impulso a 90 RF (spettroscopia di acquisizione dell’impulso) senza alcuna soppressione dell’acqua o sofisticata preparazione del campione.
Questo studio è il primo che mira alla valutazione della glicemia mediante NMR nel sangue intero utilizzando uno spettrometro a basso campo. Gli spettri NMR di soluzioni a base acquosa, come il plasma o il sangue intero, mostrano una risonanza dell’acqua dominante; la sua intensità è di circa 10.000 volte superiore a quello dei segnali del metabolita. I segnali vicino al picco dell’acqua, come il glucosio, sono coperti dal fianco del segnale dell’acqua e dai contributi di altri metaboliti del sangue. Ciò impedisce l’integrazione diretta e la quantificazione dei segnali del glucosio, che richiede approcci di analisi differenti.
Il test di fattibilità dell’NMR a basso campo per la valutazione della concentrazione di glucosio nel sangue intero è stato condotto con un approccio graduale: in una prima fase sono state analizzate soluzioni acquose con concentrazioni note di glucosio, seguite da studi nel plasma bovino in una seconda fase. Infine sono stati valutati campioni di sangue intero umano prelevati durante il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e i risultati sono stati confrontati con quelli dei metodi stabiliti.
Tutte le misurazioni del livello di glucosio sono state effettuate su uno spettrometro NMR da banco da 1 T, lo Spinsolve Carbon di Magritek, ad una temperatura del campione di 301 K. L’unica eccezione (a causa della disponibilità limitata) è il confronto degli spettri di sangue intero e plasma, che è stato condotto su uno Spinsolve Carbon Ultra di Magritek operante a 1,5 T e quindi presentando SNR più elevato e migliore risoluzione spettrale. È stato eseguito lo shimming con un campione al 10% di H2O e al 90% di D2O ogni giorno prima dell’OGTT.
Sensibilità e accuratezza del dispositivo NMR
Uno studio di fattibilità generale sulla determinazione del glucosio mediante NMR da banco è stato condotto preparando quattro soluzioni di glucosio a diverse concentrazioni. Come soluzione madre è stato utilizzato Glucosio in polvere disciolto in acqua per preparazioni iniettabili (4.040 mg/dL) diluendo 150 μL con quattro diversi volumi di acqua (11,85, 3,85, 2,25 e 1,56 ml). Le risultanti concentrazioni di glucosio, 50, 150, 250 e 350 mg/dL, sono state analizzate cinque volte utilizzando un HemoCue Glucose 201 RT, un dispositivo PoC comunemente usato per la determinazione della glicemia in vitro. L’HemoCue automaticamente moltiplica i risultati per 1,11 per convertire gli input di sangue intero in valori plasmatici equivalenti. Per evitare distorsioni annulliamo questo fattore moltiplicativo. Ogni campione è stato poi analizzato cinque volte di seguito con un’acquisizione di impulsi 1H con tempo di ripetizione 9 s, angolo di impulso 90 , tempo di permanenza 500 μs, 16 384 punti, 128 medie e quattro scansioni dummy. Per ogni misura sono stati necessari 20 min.
I risultati sono stati valutati riferendosi al picco di glucosio a 3,42 ppm. L’integrazione diretta dei picchi di glucosio è difficile, poiché il segnale di fondo della risonanza dell’acqua in questa regione può spostarsi da un campione all’altro. Quindi è stata utilizzata una correzione smoother Whittaker per rimuovere il fondo dell’acqua nella regione spettrale di interesse. Il sistema ha calcolato una versione rielaborata per ogni spettro come linea di base. Questa linea di base è stata quindi sottratta dallo spettro ed è stato integrato il segnale rimanente nell’intervallo da 3,3 a 3,9 ppm. L’area è stata confrontata con i valori di riferimento in un grafico xy, la relazione è stata assunta come lineare sull’intero intervallo e quindi dotata di una funzione lineare mediante la regressione di Passing-Bablok. In questo modo è stato possibile calcolare i livelli di glucosio tramite gli spettri NMR.
Riproducibilità della determinazione del glucosio nel plasma bovino
La stessa configurazione analitica e lo stesso principio di valutazione sono stati applicati a una soluzione più complessa di plasma bovino con glucosio di controllo poiché il plasma contiene anche la maggior parte delle proteine del sangue. È stata preparata una soluzione di acido metanoico al 2,0% come standard per queste determinazioni e le successive analisi del sangue intero. I campioni di plasma (600 μL) sono stati mescolati con 70 μL di soluzione di acido metanoico e il tubo NMR è stato riempito con 600 μL della soluzione. Gli spettri sono stati riferiti al picco dell’acido metanoico. Prima di poter eseguire analisi su sangue umano sono state condotte prove su sangue intero.
Analisi di campioni di sangue umano intero
Nell’ultima fase sono stati analizzati 122 campioni di sangue intero. La comune concentrazione di glucosio nei donatori di sangue sani è approssimativamente stabilita tra 60 e 100 mg/dL. In collaborazione con il dipartimento del diabete dell’ospedale universitario di Tubinga, centro tedesco per la ricerca sul diabete, è stato possibile ottenere campioni con concentrazioni più elevate da adulti durante il corso di test OGTT. I valori glicemici di riferimento sono stati determinati dal Laboratorio Centrale (CLab) dell’ospedale tramite un analizzatore automatico per provette con il metodo dell’esochinasi. Inoltre, è stata misurata la concentrazione di glucosio con metodo della glucosio deidrogenasi modificato. Il grafico Bland-Altman (Figura 1) con i valori CLab e PoC mostra i valori anomali, che vanno oltre l’1,96 più l’intervallo di deviazione standard. Cinque campioni sono stati quindi esclusi da ulteriori analisi risultando in 117 campioni di sangue intero.
(Advia XPT)
Confronto di diverse strategie di elaborazione dei dati per la determinazione del glucosio
Grazie alla calibrazione interna dell’intensità degli spettri, applicata automaticamente dai sistemi Spinsolve, è possibile avere un confronto quantitativo di diverse misure senza necessità di una ulteriore normalizzazione dei dati. Tuttavia, è possibile normalizzare le intensità spettrali rispetto all’integrale dello standard interno (acido metanoico con concentrazione nota) che consente di comprendere gli errori di manipolazione, ma richiede anche una linea di base stabile per consentire una corretta integrazione. Ciò è correlato al metodo per analizzare gli spettri NMR mediante deconvoluzione: le linee spettrali sono adattate con funzioni lorentziane o gaussiane per modellare il segnale acquisito, integrato per la quantificazione. Le linee lorentziane sono state adattate all’acido metanoico e le linee gaussiane ai picchi di glucosio a 3,79 e 3,42 ppm. La forte sovrapposizione del segnale con il picco d’acqua rende difficile il montaggio dello spettro nel suo complesso, per ovviare a questo problema è stato ridotto l’intervallo a 0,25 ppm attorno ai centri del picco. Questo ha permesso un’approssimazione polinomiale del primo ordine del fondo. Di solito gli spettri sono costituiti da diverse migliaia di punti dati, ma solo pochi sono necessari per la quantificazione. Questi non sono però facilmente identificati in presenza di segnali di fondo molto importanti che non permettono di identificare correttamente la posizione dei picchi.
Grazie alla proiezione a strutture latenti (PLS) l’analisi viene correlata alle componenti principali (PCA) e si ottiene una riduzione dei dati con identificazione dei componenti principali.
Una ulteriore versione del metodo è la proiezione ortogonale alle strutture latenti (OPLS) che prevede la scomposizione dei dati in due diversi tipi di componenti: quelli che costituiscono un maggior contributo alla quantificazione e quelli che non contribuiscono (“ortogonali”). Questo facilita l’interpretazione delle componenti mostrando quali segnali contribuiscono al modello e quali no. Poiché è possibile ottenere facilmente spettri di glucosio tipici, abbiamo preferito il metodo OPLS rispetto al PLS o PCA per la nostra analisi.
La conoscenza preliminare degli spettri del glucosio ha consentito la riduzione dell’intervallo spettrale al range tra 3.0 e 4.0 ppm.
Risultati
Per la giusta interpretazione dei dati è stato utilizzato un metodo OPLS, in grado di gestire gli spettri senza grossi problemi analogamente alla regressione SVM. Confrontiamo i risultati dei tre metodi per i campioni OGTT nella Tabella 1. Le linee guida dell’Associazione medica tedesca per i test di laboratorio sono state verificate rispetto ai metodi di quantificazione. Le linee guida richiedono una differenza non superiore all’11% rispetto al sistema di riferimento nell’intervallo di concentrazione di glucosio tra40 e 400 mg/dL.
La Figura 2 mostra i tipici spettri di sangue intero e plasma a 1,5 T a una concentrazione di glucosio nel sangue di circa 100 mg/dL (5,6 mmol/L). Il picco dell’acqua domina lo spettro a 4,75 ppm; altri segnali visibili nel plasma e nel sangue intero sono stati identificati a 1,26 ppm (CH2), 0,9 ppm (CH2CH3) e 2,0 ppm (CH2C=gruppo C).I segnali proteici (principalmente albumina) coprono l’intero range da 0,8 a 4,0 ppm con un massimo intorno a 3,2 ppm. Infine, ampi segnali glicemici risultanti dalla sovrapposizione di diverse specie atomiche 1H sono visibili a 3,42, 3,61 e 3,79 ppm. Si noti che il picco di glucosio a 5,23 ppm è sovrastato dal segnale dell’acqua. I contributi proteici come albumina, istidina e arginina, si sovrappongono ai segnali del glucosio a circa 3,20 ppm. I metaboliti taurina a 3,41 ppm e mio-inositolo a 3,63 ppm possono influenzare l’area di picco dei segnali del glucosio.
In base a queste concentrazioni ci aspettiamo che il loro contributo sia almeno 10 volte inferiore a quello del glucosio. Dal momento che le concentrazioni di questi metaboliti sono relativamente basse e abbastanza costanti, non sono stati considerati durante la quantificazione.
Integrazione spettrale
Nella figura 3 sono riportate le regressioni lineari degli integrali degli spettri NMR tra 3,3 e 3,9 ppm dopo la correzione della linea di base tramite il Whittaker smoother del glucosio di riferimento (Figura 3A), del plasma bovino (Figura 3B) e della serie OGTT (Figura 3C). E’ interessante notare l’efficacia della correzione della linea di base applicata, che porta a spettri parziali con una linea di base quasi piatta. L’accuratezza complessiva del metodo NMR può essere stimata utilizzando i grafici di Bland-Altman dove è possibile notare che il 95% dei dati rientra nella deviazione.
Considerazioni sulla Tecnica NMR per determinazione del glucosio nel sangue
Il sistema Spinsolve utilizzato in questo lavoro si è dimostrato uno strumento valido ed efficiente per la determinazione del glucosio. E’ stata utilizzata una sequenza di acquisizione di impulsi molto semplice e non è stata applicata alcuna soppressione dell’acqua, aspetto che ha reso il metodo presentato facile da usare. Ulteriori miglioramenti nella quantificazione potrebbero essere ottenuti utilizzando un’adeguata soppressione dell’acqua. E’ tuttavia da considerare che la soppressione dell’ampia risonanza dell’acqua a un’intensità di campo di 1 T riduce anche significativamente i segnali del glucosio, poiché non è possibile scegliere la larghezza di banda di soppressione abbastanza piccola. La larghezza di riga fornita dallo spettrometro Spinsolve a 1,5 T (rispetto allo spettrometro Spinsolve standard a 1,0 T) riduce il fondo del picco dell’acqua negli spettri in modo significativo e quindi può aumentare la stabilità e l’accuratezza delle misure.
La quantificazione NMR del glucosio in campioni di sangue intero è possibile con una preparazione minore del campione, un moderno spettrometro da banco da 1 T e metodi di valutazione ben definiti.
