Analisi sul latte: contenuto di grassi, lattosio e acqua
La determinazione di acqua, grassi e lattosio all’interno del latte è un tipo di analisi normalmente eseguita per la caratterizzazione del prodotto.
L’utilizzo dell’NMR a questo scopo è un approccio relativamente nuovo, ma di grande interesse analitico in quanto è possibile sfruttare questa tecnica per una quantificazione semplice, veloce e senza utilizzo di grosse quantità di solvente.
Spettrometria NMR
Nella figura 1 è possibile vedere uno spettro NMR di latte vaccino misurato con l’NMR da banco Spinsolve 60 ULTRA di Magritek, registrato sia con impulsi standard che con sequenza di soppressione del solvente. La soppressione del solvente è necessaria in quanto circa l’87% del latte è costituito da acqua ed è quindi un segnale predominante rispetto agli altri.
Gli spettri del latte mostrano 3 regioni principali di interesse. La regione 1 tra 0,5 e 3ppm mostra i segnali alifatici del grasso, la regione 2, tra 3 e 4ppm mostra per lo più picchi del lattosio e la regione 3, centrata a 4,7ppm contiene per lo più segnali dell’acqua ma anche alcuni picchi dei grassi e del lattosio che restano coperti dal segnale predominante dell’acqua. Nella tabella 1 sono riportati i valori integrali delle 3 regioni.
Andiamo a valutare i diversi composti da analizzare singolarmente.
Determinazione quantitativa dei grassi nel latte
Nel latte sono presenti circa 400 diversi acidi grassi, costituiti da una miscela di trigliceridi con diversi gradi di saturazione. Infatti, circa il 65% degli acidi grassi sono grassi saturi, il 30% sono monosaturi e quindi con un solo doppio legame, e un 5% di acidi grassi sono polisaturi e quindi con più di un doppio legame.
Il contenuto di grassi può essere determinato con l’NMR mediante una semplice curva di calibrazione, ottenuta misurando campioni di latte con quantità nota di grassi. Per la costruzione della curva di calibrazione sono stati utilizzati 8 campioni standard letti nelle stesse condizioni sperimentali utilizzate per l’analisi di routine. Le condizioni sperimentali sono: 4 scansioni, 60s di tempo di ritenzione e 6.4s di tempo di acquisizione.
La regione spettrale tra 0,20 e 2,90 ppm è stata utilizzata per tutti gli otto campioni standard e questi valori sono stati utilizzati per costruire la curva di calibrazione mostrata in Figura 2.
Una volta costruita l’equazione della calibrazione, questa può essere utilizzata per calcolare il contenuto di grassi espresso per [g/100ml] utilizzando l’equazione:
Dove x è semplicemente il valore integrale della regione tra 0,20 e 2,90 ppm.
Determinazione quantitativa del lattosio
Il lattosio è un disaccaride formato da glucosio e galattosio. I suoi picchi nello spettro del latte sono distribuiti nella regione tra 3,4 ppm e 5,5 ppm.
Alcuni picchi si sovrappongono al segnale dell’acqua a 4,7 ppm ma la maggior parte dei segnali del lattosio, a circa 3,79 ppm, può essere completamente separata dall’acqua sopprimendone il segnale (Spettro in basso di Figura 1). Questo segnale può essere utilizzato per quantificare il contenuto di lattosio. A tal fine è stata costruita una curva di calibrazione misurando quattro campioni standard con concentrazione nota di lattosio in acqua. Gli spettri soppressi di questi quattro campioni sono stati misurati con lo Spinsolve 60 Ultra utilizzando sempre gli stessi parametri di acquisizione. La regione spettrale tra 2.90 e 3,86 ppm è stata integrata per tutti e quattro i campioni standard e per costruire la curva di calibrazione per il lattosio riportata in Figura 3.
Applicando una semplice regressione lineare si ottiene la seguente equazione:
L’equazione fornisce il contenuto di lattosio espresso in [g/100mL].
Nella Tabella 2 sono riportati i tipici contenuti di lattosio e grassi in diverse marche di latte, comparati con i risultati ottenuti con la tecnica NMR. Come si vede, i risultati sono assolutamente in linea con quelli da etichetta.
Determinazione del contenuto d’acqua
Come già detto il principale componente del latte è l’acqua, che domina lo spettro con un ampio segnale a 4,7 ppm e si sovrappone in parte ai segnali del lattosio e dei grassi. A causa di queste sovrapposizioni non è possibile determinare in modo diretto il contenuto d’acqua. Il primo passaggio è calcolare i contributi del lattosio e dei grassi, poi si sottraggono dall’integrale totale della regione 3. Per quantificare l’acqua è necessario utilizzare spettri del latte acquisiti senza soppressione del solvente.
Per calcolare il segnale generato dal lattosio nella regione dell’acqua è necessario prima quantificare il lattosio all’interno del campione mediante l’utilizzo della soppressione. Una volta determinato il contenuto di lattosio è possibile calcolare quanto segnale sottrarre nello spettro 1D non soppresso tramite l’equazione:
Dove CLac è la concentrazione di lattosio nel campione di latte, CLac,ref la concentrazione di lattosio nel campione di riferimento e ILac,ref il segnale generato dal campione di calibrazione nella regione integrata per la quantificazione dell’acqua.
Per stimare il contributo del grasso nell’integrale del segnale dell’acqua è necessario calcolare la quantità di grasso nello spettro soppresso. Visto che il segnale è interferito dall’acqua solo in una regione, delle due caratteristiche dei grassi, è importante conoscere il rapporto del segnale tra la Regione 1 (3,50 -6,20 ppm) e la Regione 2 (0,20 -2,90 ppm), per correggere il segnale dell’acqua dopo aver determinato la quantità di grasso nel campione di latte con segnale soppresso. Il rapporto tra Regione1/Regione2 è 8,66/100, dato stabile per i campioni di latte di marche diverse.
Una volta noto il contributo di lattosio e di grassi nella regione interferita l’integrale può essere corretto:
E quindi il contenuto di acqua nel campione di latte può essere calcolato com [mol/L]:
o come [g/100mL]:
Le misure sul latte sono state ripetute cinque volte e i risultati sono riportati nella seguente Tabella 3.
Conclusioni
Lo spettrometro NMR da banco Spinsolve Ultra è una tecnica affidabile e ripetibile per la determinazione del contenuto di acqua, lattosio e grasso nel latte. I risultati dimostrano una buona riproducibilità e sono comparabili con i valori riportati in etichetta.
