Caratterizzazioni di molecole farmaceutiche con 1mg di campione tramite NMR da banco
Spesso in diversi ambiti di ricerca del settore farmaceutico, alla fine del processo di sintesi sono spesso disponibili solo pochi milligrammi di prodotto. Per verificare le strutture sintetizzate è possibile utilizzare sequenze NMR multidimensionali eteronucleari, come HSQC o HMBC. La sensibilità è in genere un fattore limitante per eseguire la determinazione con questi metodi in un tempo analitico ragionevole. Esaminiamo quali tempi di misura sono necessari per eseguire queste analisi su uno spettrometro NMR da banco Spinsolve da 80 MHz quando la quantità di campione si avvicina al limite di un mg. Abbiamo eseguito questi test su tre molecole con pesi molecolari crescenti, per coprire il range di interesse nelle applicazioni farmaceutiche.
Per una caratterizzazione accurata di una molecola sono necessari i metodi 1H e 13C NMR. Anche in uno spettrometro NMR ad alto campo, potrebbero essere necessarie diverse ore per registrare un NMR 13C di un campione da 1 mg. Una soluzione per abbreviare l’acquisizione degli spettri 13C è sfruttare i dati eteronucleari 2D, in cui le informazioni sul carbonio vengono rilevate con maggiore sensibilità tramite il segnale 1H. Questi metodi 2D sono molto più rapidi da misurare e contengono più informazioni sulla struttura della molecola rispetto agli esperimenti 1D. Uno dei metodi NMR 2D più frequentemente utilizzati è il HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), che mette in correlazione gli spostamenti chimici di protoni e carbonio, collegati tramite un legame chimico, in modo da poter sapere quali protoni e carboni sono direttamente collegati nella molecola. Alcune varianti dell’HSQC contengono l’informazione aggiuntiva di uno spettro DEPT-135 quando vi sono picchi incrociati. Questo esperimento si chiama HSQC-me (Multiplicity Edited Heteronuclear Single Quantum Coherence) e codifica le informazioni aggiuntive su quanti atomi di idrogeno sono attaccati a ciascun atomo di carbonio. I gruppi CH e CH3 vengono visualizzati con un’intensità positiva mentre i gruppi CH2 hanno un’intensità negativa.
La prima molecola analizzata è la fenacetina, un tipico farmaco di piccole dimensioni con un peso molecolare di 179 g/mol utilizzato per alleviare il dolore e ridurre la febbre. La Figura 1 confronta gli spettri HSQC-me raccolti per 7 mg e 1 mg di fenacetina disciolti in DMSO-d6. La concentrazione per 7 mg è sufficientemente elevata da consentirci di acquisire l’HSQC-me con uno straordinario rapporto segnale-rumore in soli 3 minuti, utilizzando il campionamento non uniforme (NUS) (Fig. 1a). Per il campione contenente 1 mg di fenacetina, abbiamo impiegato un tempo di misurazione totale di soli 34 minuti per risolvere tutti i segnali di questo composto (Fig. 1b).
Per il nostro secondo esempio, analizziamo Zolmitriptan, un composto con peso molecolare di 287 g/mol utilizzato per trattare l’emicrania e la cefalea a grappolo attraverso il legame selettivo ai recettori della serotonina. Per confronto abbiamo preparato due campioni, uno con 3 mg e il secondo con 1 mg di Zolmitriptan sciolto in DMSO-d6. Il tempo di misura per il campione da 3 mg è stato impostato su 34 minuti acquisendo 256 passaggi con 8 scansioni e un tempo di ripetizione di 1 secondo per ottenere un HSQC di riferimento con un buon SNR. La Figura 2b mostra l’HSQC-me per il campione da 1 mg acquisito con lo stesso numero di passaggi e tempo di ripetizione del riferimento ma con 16 scansioni. Lo spettro 2D ha richiesto 68 minuti.
Come terzo esempio abbiamo l’acido gibberellico, un fitormone comunemente usato come regolatore della crescita delle piante con un peso molecolare di 346 g/mol. Abbiamo preparato un primo campione con 1,5 mg di Metanolo-d4 e abbiamo ottenuto uno spettro in 68 minuti. Un secondo campione è stato preparato con soli 0,7 mg di acido gibberellico. Aumentando il numero di scansioni a 64, siamo riusciti ad acquisire uno spettro HSQC-me con un tempo di misurazione di 4,5 ore, in cui è stato possibile identificare tutte le correlazioni H-C.
In conclusione, gli esperimenti HSQC-me condotti su queste tre diverse strutture molecolari dimostrano che un milligrammo di campione è sufficiente per ottenere spettri di alta qualità entro un tempo di misurazione dell’ordine di un’ora. Inoltre, anche riducendo ulteriormente la quantità di campione a 0,7 mg per il campione con il peso molecolare più elevato (346 g/mol) analizzato in questo progetto, abbiamo ottenuto uno spettro completamente risolto in circa 4 ore. In sintesi, è possibile ottenere una caratterizzazione completa di una quantità molto piccola di uno scaffold chimico entro un tempo di misurazione ragionevole utilizzando un sistema NMR da banco Spinsolve.
